AAV

AAV

腺相關病毒 Adeno-associated virus(AAV)是一個常見的人細小病毒,自然缺陷、無包被和無致病原性。AAV複製周期由兩個明顯的階段構成:潛伏期和增殖期。

基本信息

基本信息

腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科,依賴病毒屬的單鏈DNA病毒, 其正負鏈各半,基因組大小 4.7kb。病毒顆粒結構為正二十面體,直徑20-26nm,耐熱,耐有機溶劑。AAV具有多種常見血清型,100多種病毒變種。

在存在輔助病毒諸如腺病毒(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)、皰疹病毒、牛痘病毒等條件下(Yakobson等,1989),AAV能複製產生子代病毒顆粒。在缺少輔助病毒的情況下,AAV整合其基因組到人類19號染色體的一個特別位點(AAVS位點),直到有輔助病毒將其從潛伏狀態下拯救出來(Kotin等,1990)。但研究普遍認為,AAV以不整合的形式為主,整合率小於2%。AAV的位點特異性的整合能力、其自然缺陷及其免疫原性低使其成為理想的基因治療載體變為可能。

重組AAV (rAAV) 載體能高效且相對特異性轉導體內不同組織,如肺(Flotte等,1993;Conrad等,1996;Halbert等,1997)、腦(Kaplitt等,1994)、肌肉(Xiao等,1996)、視網膜(Ali,1996;Flannery等1997)、中樞神經系統(Peel等,1997)和肝臟(Xiao等,1998)等。但AAV對於體外細胞水平的轉導效果欠佳。

病毒結構

AAV基因組是一個線性、單鏈DNA(ssDNA)分子,由4680個核苷酸構成,在每個末端含有一個145個鹼基組成的末端重複序列(ITR)(Srivastava等,1983)。ITR序列摺疊成髮夾結構,是其DNA複製起始和包裝重組AAV病毒顆粒所需的唯一已知順式作用元件。ITR元件位於兩個翻譯開放閱讀框(ORF)的兩側。左側ORF(或rep基因)編碼四個非結構蛋白質稱為Rep78、68、52和40,對於病毒DNA複製和包裝是關鍵性的。右側的ORF(或cap基因)編碼三個結構蛋白質VP1、VP2和VP3(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)。

複製過程

DNA複製,VAI RNA基因生成一個小RNA轉錄物增進AAV capsid mRNA的翻譯。

此繁瑣過程的局限性阻止了rAAV廣泛發展為基因治療的載體。如上所述載體的生成總是導致載體的明顯Ad污染,因此需要熱處理和嚴格的純化方法滅活和去除Ad病毒顆粒污染。儘管載體和包裝質粒之間通常沒有同源序列,但是經常產生野生型樣有複製能力的AAV(rcAAV)(Allen等,1997;Wang等,1998)。已經進行了許多嘗試改進rAAV載體的包裝效率。它們包括:發展表達一些或所有包裝所需的AAV基因的細胞系(Yang等,1994;Clark等,1995;Tamayose等,1996;Inoue和Russell,198),構建Ad輔助質粒能夠用來替代Ad感染(Matsu***a等,1998;Xiao等,1998b)和發展重組Ad攜帶rAAV載體基因組(Gao等,1998)。

製備過程

“一株輔毒+一株載體細胞株”策略製備的AAV “一株輔毒+一株載體細胞株”策略製備的AAV

在rAAV的製備上通常採用經典的三質粒共轉染法(Helper-free AAV包裝系統) ,該方法含有四個要素:三個質粒和一株細胞。即其一個質粒(載體質粒)含有目的基因表達盒,其兩端是AAV2的倒轉末端重複序列(ITR);一個質粒(包裝質粒)反式提供具有AAV複製和包裝功能的蛋白Rep和Cap;第三個質粒(輔助質粒)含有輔助毒Ad5的重要元件E1a、E1b、E2a、E4等。將三個質粒共轉染合適的細胞株(通常是人胚腎293細胞),就能在細胞裂解液中得到攜帶目的基因的rAAV。 這種製備方法不僅需要製備大量高質量的載體質粒和助手質粒,且rAAV的產量在很大程度上取決於轉染的效率。

而伍志堅和吳小兵等報導了另一種AAV的包裝系統 。將三質粒共轉染法的經典四因素包裝系統兩兩合併,改為二因素包裝系統:一是將輔助質粒與Rep和Cap合併,成為一種能提供AAV複製與包裝功能的重組單純皰疹病毒HSV-1;一是將載體DNA與宿主細胞合併,建立一種rAAV的載體細胞株。即用一種病毒感染一個載體細胞株的策略製備重組AAV,這種包裝系統極大地提高了AAV的生產效率,但會增高野生型AAV回復突變的可能性。

Helper-free方法相對不如第二種AAV包裝體系高效,但是安全性及純度各方面會更高,因此仍是目前基因治療及研發用AAV的主流製備方法。

載體特點

安全性好

對肌肉、肝臟、神經組織等轉導效率高

載體自身免疫原性低

長期表達

比較穩定,易於保存和運輸

缺點:容量較小

組織嗜性

AAV感染不同組織效果圖 AAV感染不同組織效果圖
不同AAV血清型的組織親和性 不同AAV血清型的組織親和性

AAV1載體:明顯的骨骼肌嗜性(包括心肌),神經組織也可以感染;

AAV2載體:泛嗜性;最早套用的AAV載體。有效轉導肌肉,肝臟,腦組織,對於視網膜的轉導效率和表達水平良好

AAV5載體:視網膜、神經系統、關節滑膜嗜性、肺;

AAV8載體:明顯肝嗜性,視網膜、神經組織也可以感染;

AAV9載體:心肌嗜性,可穿過血腦屏障;

AAV-DJ:廣譜性侵染各種細胞,可做細胞實驗

免疫反應:先存免疫(如AAV2)、反覆給藥引起針對AAV的免疫反應

安全性

一般認為AAV病毒本身對人體不致病。一般AAV病毒載體的生物安全等級是BSL1。但是對於攜帶致病基因或有害因子基因的AAV載體則應歸於BSL2,應遵守以下操作注意事項:

注意事項

在相應的生物安全等級環境和要求下進行操作。

避免與製品直接接觸(經傷口或不小心針刺注入、誤食、大量吸入、黏膜接觸等)。

在操作過程中不慎皮膚接觸或濺入眼睛,立即用大量清水沖洗;

乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑無法滅活AAV病毒,因此酒精消毒對於去除AAV病毒沾染無效。

消毒可以採用的手段包括清水清洗、高壓、強氧化性的消毒液(如巴斯消毒液)清消、強鹼性液體浸泡等。

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