培養基

培養基

培養基(Medium)是供微生物、植物組織和動物組織生長和維持用的人工配製的養料,一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。不同培養基可根據實際需要,添加一些自身無法合成的化合物,即生長因子。有些微生物,如自養型微生物,不需要碳源,所以上述物質只具有一般性。

培養基的配製

1.配料

配方換算→在容器中加入少量水(蒸餾水,自然水)→按照配方稱取各種藥品(依次加入)→加足所需水量(一藥一勺,取藥後立即蓋上瓶蓋)。

2.溶解

澱粉溶解:少量冷水調成糊狀

加熱溶解,特別是加有瓊脂的培養基,一定要煮沸,瓊脂的熔解溫度95-97℃ ,且需要邊加熱邊攪拌以防止燒焦。

3.調PH

用1N的鹽酸或1N的 NaOH把培養基調節到所要求的值。

4.過濾

濾紙或棉花進行過濾。(有時可以省去)

5.分裝

一般培養基放在三角瓶或試管中滅菌使用。

(1)三角瓶

若作靜置培養,則100ml培養基/250ml的三角瓶,最多不能超過150ml培養基/250ml的

三角瓶,否則滅菌時培養基沸騰容易污染棉塞,造成染菌;若作搖瓶培養,則15-20ml培養基/250ml的三角瓶,保證通氣良好。

(2)試管分裝

液體培養基一般裝4-5ml,約試管的1/4高度;

固體斜面培養基一般裝3-4ml,約試管的1/5高度。

6.包紮

分裝好後,塞上棉塞,在用牛皮紙將棉塞包裹好,防止滅菌時水份進入把棉塞弄濕。

7.滅菌

按配方上要求的溫度、壓力進行高壓蒸汽滅菌。如果滅菌的溫度太高,營養成分會被破壞,培養

基中的糖、胺基酸會使培養基的顏色變深。

8.擺斜面

滅菌後需要擺斜面的試管要趁熱斜著擺放,使其凝固成為一個斜面,約占試管長度的1/2。

9.貯存

培養基在30℃下放置一天,無污染的即可使用。一般用牛皮紙包裹好存放於2-8℃冰櫃中備用

培養基配置原則

1、選擇適宜的營養物質

總體而言,所有微生物生長繁殖均需要培養基含有碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水及能源,但由於微生物營養類型複雜,不同微生物對營養物質的需求是不一樣的,因此首先要根據不同微生物的營養需求配製針對性強的培養基。自養型微生物能從簡單的無機物合成自身需要的糖類、脂類、蛋白質、核酸、維生素等複雜的有機物,因此培養自養型微生物的培養基完全可以(或應該)由簡單的無機物組成。例如,培養化能自養型的氧化硫硫桿菌(Thiobacillus thiooxdans)的培養基組成見表3.9。在該培養基配製過程中並末專門加入其他碳源物質,而是依靠空氣中和溶於水中的CO2為氧化硫硫桿菌提供碳源。

就微生物主要類型而言,有細菌、放線菌、酵母菌、黴菌、原生動物、藻類及病毒之分,培養它們所需的培養基各不相同。在實驗室中常用牛肉膏蛋白腖培養基(或簡稱普通肉湯培養基)培養細菌,用高氏I號合成培養基培養放線菌,培養酵母菌一般用麥芽汁培養基,培養黴菌則一般用查氏合成培養基。

2、營養物質濃度及配比合適

培養基中營養物質濃度合適時微生物才能生長良好,營養物質濃度過低時不能滿足微生物正常生長所需,濃度過高時則可能對微生物生長起抑制作用,例如高濃度糖類物質、無機鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進微生物的生長,反而起到抑菌或殺菌作用。另外,培養基中各營養物質之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和(或)代謝產物的形成和積累,其中碳氮比(C/N)的影響較大。嚴格地講,碳氮比指培養基中碳元素與氮元素的物質的量比值,有時也指培養基中還原糖與粗蛋白之比。例如,在利用微生物發酵生產谷氨酸的過程中,培養基碳氮比為4/1時,菌體大量繁殖,谷氨酸積累少;當培養基碳氮比為3/1時,菌體繁殖受到抑制,谷氨酸產量則大量增加。再如,在抗生素髮酵生產過程中,可以通過控制培養基中速效氮(或碳)源與遲效氮(或碳)源之間的比例來控制菌體生長與抗生素的合成協調。

3、控制pH條件

培養基的pH必須控制在一定的範圍內,以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產生代謝產物。各類微生物生長繁殖或產生代謝產物的最適pH條件各不相同,一般來講,細菌與放線菌適於在pH7-7.5範圍內生長,酵母菌和黴菌通常在pH4.5-6範圍內生長。值得注意的是,在微生物生長繁殖和代謝過程中,由於營養物質被分解利用和代謝產物的形成與積累,會導致培養基pH發生變化,若不對培養基pH條件進行控制,往往導致微生物生長速度下降或(和)代謝產物產量下降。因此,為了維持培養基pH的相對恆定,通常在培養基中加入pH緩衝劑,常用的緩衝劑是一氫和二氫磷酸鹽(如KH2PO4 和K2HPO4)組成的混合物。K2HPO4溶液呈鹼性,KH2PO4溶液呈酸性,兩種物質的等量混合溶液的pH為6.8。當培養基中酸性物質積累導致H+濃度增加時,H+與弱鹼性鹽結合形成弱酸性化合物,培養基pH不會過度降低;如果培養基中OH-濃度增加,OH-則與弱酸性鹽結合形成弱鹼性化合物,培養基pH也不會過度升高。

但KH2PO4 和K2HPO4緩衝系統只能在一定的pH範圍內(6.4-7.2)起調節作用。有些微生物,如乳酸菌能大量產酸,上述緩衝系統就難以起到緩衝作用,此時可在培養基中添加難溶的碳酸鹽(如CaCO3)來進行調節,CaCO3難溶於水,不會使培養基pH過度升高,但它可以不斷中和微生物產生的酸,同時釋放出CO2,將培養基pH控制在一定範圍內。

在培養基中還存在一些天然的緩衝系統,如胺基酸、肽、蛋白質都屬於兩性電解質,也可起到緩衝劑的作用。

4、控制氧化還原電位(redox potential)

不同類型微生物生長對氧化還原電位(F)的要求不一樣,一般好氧性微生物在F值為+0.1V以上時可正常生長,一般以+0.3一+0.4V為宜,厭氧性微生物只能在F值低於+0.1V條件下生長,兼性厭氧微生物在F值為+0.1V以上時進行好氧呼吸,在+0.1V以下時進行發酵。F值與氧分壓和pH有關,也受某些微生物代謝產物的影響。在pH相對穩定的條件下,可通過增加通氣量(如振盪培養、攪拌)提高培養基的氧分壓,或加入氧化劑,從而增加F值;在培養基中加入抗壞血酸、硫化氫、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等還原性物質可降低F值。

5、原料來源的選擇

在配製培養基時應儘量利用廉價且易於獲得的原料作為培養基成分,特別是在發酵工業中,培養基用量很大,利用低成本的原料更體現出其經濟價值。例如,在微生物單細胞蛋白的工業生產過程中,常常利用糖蜜(製糖工業中含有蔗糖的廢液)、乳清(乳製品工業中含有乳糖的廢液)、豆製品工業廢液及黑廢液(造紙工業中含有戊糖和己糖的亞硫酸紙漿)等都可作為培養基的原料。再如,工業上的甲烷發酵主要利用廢水、廢渣作原料,而在我國農村,已推廣利用人畜糞便及禾草為原料發酵生產甲烷作為燃料。另外,大量的農副產品或製品,如鼓皮、米糠、玉米漿、酵母浸膏、酒糟、豆餅、花生餅、蛋白腖等都是常用的發酵工業原料。

6、滅菌處理

要獲得微生物純培養,必須避免雜菌污染,因此對所用器材及工作場所進行消毒與滅菌。對培養基而言,更是要進行嚴格的滅菌。對培養基一般採取高壓蒸汽滅菌,一般培養基用1.05kg/cm2,121.3℃條件下維持15-30min可達到滅菌目的。在高壓蒸汽滅菌過程中,長時間高溫會使某些不耐熱物質遭到破壞,如使糖類物質形成氨基糖、焦糖,因此含糖培養基常在0.56kg/ cm2,112.6℃15-30分鐘進行滅菌,某些對糖類要求較高的培養基,可先將糖進行過濾除菌或間歇滅菌,再與其他已滅菌的成分混合;長時間高溫還會引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽離子(特別是鈣、鎂、鐵離子)結合形成難溶性複合物而產生沉澱,因此,在配製用於觀察和定量測定微生物生長狀況的合成培養基時,常需在培養基中加入少量螯合劑,避免培養基中產生沉澱,常用的螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)。還可以將含鈣、鎂、鐵等離子的成分與磷酸鹽、碳酸鹽分別進行滅菌,然後再混合,避免形成沉澱;高壓蒸汽滅菌後,培養基pH會發生改變(一般使pH降低),可根據所培養微生物的要求,在培養基滅菌前後加以調整。

在配製培養基過程中,泡沫的存在對滅菌處理極不利,因為泡沫中的空氣形成隔熱層,使泡沫中微生物難以被殺死。因而有時需要在培養基中加入消泡沫劑以減少泡沫的產生,或適當提高滅菌溫度。

特點

目前國際上流行的培養基有幾十種,常用的培養基及特點如下:

(1)MS培養基它是1962年由Murashige和Skoog為培養菸草細胞而設計的。特點是無機鹽和離子濃度較高,為較穩定的平衡溶液。其養分的數量和比例較合適,可滿足植物的營養和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養基為高,廣泛地用於植物的器官、花葯、細胞和原生質體培養,效果良好。有些培養基是由它演變而來的。

(2)B5培養基是1968年由Gamborg等為培養大豆根細胞而設計的。其主要特點是含有較低的銨,這可能對不少培養物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在B5培養基上生長更適宜,如雙子葉植物特別是木本植物。

(3)White培養基是1943年由White為培養番茄根尖而設計的。1963年又作了改良,稱作White改良培養基,提高了MgSO4的濃度和增加了鵬素。其特點是無機鹽數量較低,適於生根培養。

(4)N6培養基是1974年朱至清等為水稻等禾穀類作物花葯培養而設計的。其特點是成分較簡單,KNO3和(NH4)2SO4含量高。在國內已廣泛套用於小麥、水稻及其他植物的花葯培養和其他組織培養。

(5)KM-80培養基它是1974年為原生質體培養而設計的。其特點是有機成分較複雜,它包括了所有的單糖和維生素,廣泛用於原生質融合的培養。

微生物分類

選擇性培養基:一類根據某微生物的特殊營養要求或其對某化學、物理因素的抗性而設計的培養基,具有使混合菌樣中的劣勢菌變成優勢菌的功能,廣泛用於菌種篩選等領域。

鑑別培養基:一類在成分中加有能與目的菌的無色代謝產物發生顯色反應的指示劑,從而達到只須用肉眼辨別顏色就能方便的從近似菌落中找出目的菌菌落的培養基。例如,伊紅美藍乳糖培養基(EMB)。

常見培養基

細菌培養基

牛肉膏瓊脂培養基

牛肉膏0.3g ,蛋白腖1.0g,氯化鈉0.5g,瓊脂1.5g,水100ml

在燒杯內加水100ml,放入牛肉膏、蛋白腖和氯化鈉,用蠟筆在燒杯外作上記號後,放在火上加熱。待燒杯內各組分溶解後,加入瓊脂,不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解後補足失水,用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值到7.2-7.6,分裝在各個試管里,加棉花塞,用高壓蒸汽滅菌:1.05千克每平方厘米、121攝氏度維持15-30分鐘。

牛心培養基

細菌培養基細菌培養基

取新鮮牛心(除去脂肪和血管)250克,用刀細細剁成肉末後,加入500毫升蒸餾水和5克蛋白腖。在

燒杯上做好記號,煮沸,轉用文火燉2小時。過濾,濾出的肉末乾燥處理,濾液pH值調到7.5左右。每支試管內加入10毫升肉湯和少量碎末狀的乾牛心,滅菌,備用。

根瘤菌培養基

葡萄糖10g,磷酸氫二鉀0.5g,碳酸鈣3g,硫酸鎂0.2g,酵母粉0.4瓊脂20g,水1000ml,1%結晶紫溶液1ml。

先把瓊脂加水煮沸溶解,然後分別加入其他組分,攪拌使溶解後,分裝,滅菌,備用。

放線菌培養基

澱粉硝酸鹽培養基(高氏一號培養基)

可溶性澱粉2.0g,硝酸鉀0.1g,磷酸氫二鉀0.05g,氯化鈉0.05g,硫酸鎂0.05g,硫酸亞鐵0.001g,瓊脂2g,水100ml。

先把澱粉放在燒杯里,用5ml水調成糊狀後,倒入95ml水,攪勻後加入其他藥品,使它溶解。在燒杯外做好記號,加熱到煮沸時加入瓊脂,不停攪拌,待瓊脂完全溶解後,補足失水。調整pH值到7.2-7.4,分裝後滅菌,備用。

麵粉瓊脂培養基

麵粉60g,瓊脂20g,水1000ml

把麵粉用水調成糊狀,加水到500ml,放在文火上煮30分鐘。另取500ml水,放入瓊脂,加熱煮沸到溶解後,把兩液調勻,補充水分,調整pH值到7.4,分裝,滅菌,備用。

微藻培養基

BG-11培養基

NaNO3 1.5g,K2HPO4 ·3H2O0.04g,MgSO4·7H2O0.075g,CaCl2 ·2H2O0.036g Citric Acid (檸檬酸 )0.006g,Ferric ammonium citrate(檸檬酸鐵銨0.006g,EDTA (dinatrium-salt) 0.001g,Na2CO3 0.02g,A5 + Co solution * (A5溶液1000×)1ml Distilled Water (蒸餾水)919ml

SE培養基

NaNO3 0.25g
K2HPO4 . 3H2O 0.075g
MgSO4 . 7H2O 0.075g
CaCl2 . 2H2O 0.025g
KH2PO4 0.175g
NaCl 0.025
Soil extract 40ml
FeCl3·6H2O 0.005
Fe—EDTA 1ml
A5 solution 1000× 1ml
distilled water 958ml

Soil Extract(土壤提取液)配置方法

取花園土未施過肥0.5kg置於燒杯或三角瓶中,加入蒸餾水1000毫升,瓶口用透氣塞封口,在水浴中沸水加熱2小時,冷卻數小時,在無菌條件下過濾,取上清液,將滅菌蒸餾水加入上清液至總體積1000毫升。土壤提取液保存在4ºC備用。

Composition of the A5 solution

Add to 100 ml of distilled water:

H3BO3 286 mg
MnCl2 . 4H2O 181 mg
ZnSO4 . 7H2O 22 mg
CuSO4 . 5 H2O 7.9 mg
(NH4)6Mo7O24 .4H2O 3.9 mg

EDTA-Fe的配置方法:

將EDTA和FeCl3·6H2O分別溶於水和HCl(0.1N),混勻即可。

Na2EDTA 1g
distilled water 50ml
FeCl3·6H2O 81 mg
HCl(0.1N) 50ml

Pr培養基

Preparation: to 997 mL of glass-distilled water, add 1.0 g proteose peptone, 15.0 g agar, and the following stock solutions:

working solution g/1000 mL H2O
NaNO3 0.25
CaCl2. 2H2O 0.025
MgSO4. 7H2O 0.075
K2HPO4 0.075
KH2PO4 0.175
NaCl 0.025
A5 solution 1ml
EDTA-Fe 1ml
FeCl3 (0.05%) 1ml

A5溶液和EDTA-Fe溶液配製方法同上。

真菌培養基

薩市(Sabouraud’s)培養基

蛋白腖10g,瓊脂20g,麥芽糖40g,水1000ml

先把蛋白腖、瓊脂加水後,加熱,不斷攪拌,待瓊脂溶解後,加入40g麥芽糖(或葡萄糖),攪拌,使它溶解,然後分裝,滅菌,備用。

本培養菌是培養許多種類真菌所常用的。

馬鈴薯糖瓊脂培養基

把馬鈴薯洗淨去皮,取200g切成小塊,加水1000ml,煮沸半小時後,補足水分。在濾液中加入10g瓊脂,煮沸溶解後加糖20g(用於培養黴菌的加入蔗糖,用於培養酵母菌的加入葡萄糖),補足水分,分裝,滅菌,備用。

把這培養基的pH值調到7.2-7.4,配方中的糖,如用葡萄糖還可用來培養放線菌和芽孢桿菌。

豆芽汁培養基

黃豆芽100g,瓊脂15g,葡萄糖20g,水1000ml

洗淨黃豆芽,加水煮沸30分鐘。用紗布過濾,濾液中加入瓊脂,加熱溶解後放入糖,攪拌使它溶解,補足水分到1000ml,分裝,滅菌,備用。

把這培養基的pH值調到7.2-7.4,可用來培養細菌和放線菌。

豌豆瓊脂培養基

豌豆80粒,瓊脂5g,水200ml

瓊脂瓊脂

取80粒乾豌豆加水,煮沸1小時,用紗布過濾後,在濾液中加入瓊脂,煮沸到溶解,分裝,滅菌,備用。

食用菌菌種培養基

馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養基

20%馬鈴薯煮汁1000ml,蔗糖20g,瓊脂18g

把馬鈴薯洗淨去皮後,切成小塊。稱取馬鈴薯小塊200g,加水1000ml,煮沸20分鐘後,過濾。在濾汁中補足水分到1000ml,即成20%馬鈴薯煮汁。在馬鈴薯煮汁中加入瓊脂和蔗糖,煮沸,使它溶解後,補足水分,分裝,滅菌,備用。使用該培養基對pH值要求不嚴格,可以不測定。

綜合馬鈴薯培養基

20%馬鈴薯煮汁1000ml,磷酸二氫鉀3g,硫酸鎂1.5g,葡萄糖20g,維生素10mg,瓊脂18g

先配製20%馬鈴薯煮汁,方法同上。在煮汁中加入上述各種組分,加熱溶解後補足水分,調整pH值到6。分裝,滅菌,備用。 該培養基用於培養和保存靈芝、平菇、香菇等食用菌菌種。

菸草的培養基

在植物組織培養時,通過調節IAA和CTK的比值能影響愈傷組織分化出根或芽。CTK/IAA高時,愈傷組織分化芽。

CTK/IAA低時,分化根;CTK/IAA比例適中維持愈傷組織不分化。

愈傷組織誘導培養基製備

以MS培養基母液為基礎,向潔淨鋁鍋中順序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,鐵鹽100×母液20mL ,維生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配製得MS培養基後,再加入0.5mg·L-1的BA8mL,0.5mg·L-1的NAA8mL。然後加入實際配製培養基體積約2/3-3/4的蒸餾水,加入40g蔗糖後攪拌使其溶化,用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl調整pH值至5.8-6.0。加入14g瓊脂,將鋁鍋置於電爐上,攪拌加熱使瓊脂完全溶化,然後用蒸餾水定容至終體積2L,繼續加熱幾分鐘使之混合均勻後分裝於三角瓶中。

菸草菸草

菸草葉片愈傷組織誘導

取一無菌培養皿,用解剖刀切取1-2片無菌苗葉片置於無菌培養皿中,並用解剖刀將葉片切成2mm2左右的小片,然後將其接種於準備好的培養基上,每瓶接種5小片,一共接種6瓶。接種後的三角平置於24條件下黑暗培養1周,然後在同樣溫度下有光照和全黑暗下培養3周直至愈傷組織形成(兩種情況各置3瓶)。觀察愈傷組織誘導結果,統計愈傷組織誘導率。

器官分化及植株再生培養

將誘導的愈傷組織按類型分別轉入分化培養基上,置於連續光照,溫度20-22℃條件下培養3周,統計愈傷組織再生植株情況。

愈傷組織誘導的總體情況

菸草愈傷組織誘導培養4周后,愈傷組織基本形成,即排除因生長時間不夠而未形成愈傷的情況。具體情況見表一中所示。6瓶培養物均有愈傷形成,且都未發生污染,但誘導率幾乎各不相同。其中, 在光照條件下培養的3瓶平均愈傷誘導率為60.0℅,在黑暗條件下培養的3瓶平均愈傷誘導率為46.7%。由於實驗過程中,外植體即菸草葉片取得偏小,接種時可能已有部分外植體的大部分細胞脫水死亡,使整個實驗的愈傷組織誘導率偏低,愈傷塊偏小。

動物細胞培養基

RPMI1640培養基是一個全營養型培養基,廣泛套用於哺乳動物細胞和雜交瘤細胞的培養,如人骨髓瘤細胞、鼠雜交瘤細胞、人白細胞以及B細胞和T細胞。最初設計用於懸浮細胞培養和人白血病細胞的單層細胞培養。

特殊培養基

選擇性培養基

選擇性培養基是指根據某種微生物的特殊營養要求或其對某化學、物理因素的抗性而設計的培養基。其功能是使混合菌樣中的劣勢菌變成優勢菌,從而提高該菌的篩選效率。

酵母菌富集培養基

葡萄糖5%,尿素0.1%,硫化銨0.1%,磷酸二氫鉀0.25%,磷酸氫二鈉0.05%,七水合硫酸鎂0.1%,七水合硫酸鐵0.01%,酵母膏0.05%,孟加拉紅0.003%,pH4.5

Ashby無氮培養基

富集好氧自生固氮菌

甘露醇1%,磷酸二氫鉀0.02%,七水合硫酸鎂0.02%,氯化鈉0.02%,二水合硫酸鈣0.01%,碳酸鈣0.5%

鑑別培養基

EMB培養基

常用於鑑別E.coli

蛋白腖10g,乳糖5g,蔗糖5g,磷酸氫二鉀2g,伊紅Y0.4g,美藍0.065g,蒸餾水1000g,pH7.2

2216E培養基配方

分離海洋微生物的培養基配方

蛋白腖5g,酵母膏1g,磷酸高鐵0.01g,瓊脂15-20g,陳海水1000ml,煮沸氫氧化鈉(5%)的溶液調PH值7.6-7.8

伊紅美藍培養基

可用於檢測水中大腸桿菌的含量

首先按以下組成配製基礎培養基。

蛋白腖10g,NaCl5g

瓊脂15-20g

將上述物質溶解後,用蒸餾水定容至1000mL,調節pH為7.6。滅菌後,冷卻至60℃左右,再按下面的比例,在無菌操作條件下加入滅菌的乳糖溶液、伊紅水溶液以及美藍水溶液。搖勻後,立即倒平板。溶液中的乳糖在高溫下會破壞,因此一般使用壓力為70kPa、溫度為115℃的條件滅菌20分鐘。

基礎培養基100mL,20%乳糖溶液2mL

2%伊紅水溶液2mL,0.5%美藍水溶液1mL

天然細胞培養基

天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基,如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養技術建立早期,體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由於天然培養基製作過程複雜、批間差異大,因此逐漸為合成培養基所替代。廣泛使用的天然培養基是血清,另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是必不可少。

血清種類

目用於組織培養的血清主要是牛血清,培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因:來源充足、製備技術成熟、經過長時間的套用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的,但並不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基,含有豐富的細胞生長必須的營養成份,具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛;新牛血清取自出生24小時之內的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。顯然,胎牛血清是品質最高的,因為胎牛還未接觸外界,血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。

血清樣本血清樣本

血清的主要成分

血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很複雜的混合物,其組成成份雖大部分已知,但還有一部分尚不清楚,且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等,這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。

血清主要作用

1. 提供基本營養物質:胺基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等,是細胞生長必須的物質。

2. 提供激素和各種生長因子:胰島素、腎上腺皮質激素(氫化可的松、地塞米松)、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

3. 提供結合蛋白:結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質,如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等,轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。

4. 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

5. 對培養中的細胞起到某些保護作用:有一些細胞,如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。這種作用是偶然發現的,則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用於貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保護細胞免受機械損傷,特別是在懸浮培養攪拌時,粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子,他們在代謝解毒中起重要作用,如SeO3、硒等。

血清培養基主要問題

1. 血清的成份可能有幾百種之多,對其準確的成份、含量及其作用機制不清楚,尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識,這給研究工作帶來許多困難。

2. 血清都是批量生產,各批量之間差異很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保證每批血清的相似性極為困難,從而使實驗的標準化和連續性受到限制。

3. 對大多數細胞,在體內狀態,血清不是它們接觸的生理學液體,只是在損傷癒合以及血液凝固過程中才接觸血清,因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態,血清可能促進某些細胞的生長(成纖維細胞)同時抑制另一類細胞生長(表皮細胞)。

4. 血清含一些對細胞產生毒性的物質,如多胺氧化酶,能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長,甚至造成細胞死亡。

5. 動物個體不同,血清產地、批號不同,每批質量差異甚大,其成分不能保持一致。

6. 取材中可能帶入支原體、病毒,對細胞產生潛在影響,可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。

7. 大規模生產中,血清來源越來越困難,價格昂貴,是構成動物細胞培養對生產成本的主要部分之一。

血清的質量標準

血清質量高低取決於兩方面因素:一是取材對象,二是取材過程。用於取材的動物應健康無病並且在指定的出生天數之內,取材過程應嚴格按照操作規程執行,製備出的血清要經過嚴格的質量鑑定。WHO公布的《用動物細胞體外培養生產生物製品規程》中的要求:

1. 牛血清必須來自有檔案證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。並應具備適當的監測系統。

2. 有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

3. 證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。

4. 血清要通過濾膜過濾除菌,保證無菌。

5. 無細菌、黴菌、支原體和病毒的污染,有些國家要求無細菌噬菌體污染。

6. 對細胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質量2000年版《中國生物製品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量,細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素,支持細胞增殖檢查。

外周血培養

一、配製用水

培養基的大部分是水,所以水的質量直接影響培養基的質量。按Waymouth標準,水的電阻應為200萬歐姆,一般實驗室里以玻璃蒸餾器製備的

雙蒸水或三蒸水可以符合使用條件。

二、培養基

培養基有天然、人工兩種。一般實驗室使用的是RPMI-1640粉末培養基,以雙蒸或三蒸水配製。NaHCO3(或HCl)調pH至7.2~7.4,若pH值超

過7.6或遠低於6.8,則大多數細胞不能生長。RPMI-1640不耐高壓滅菌,使用前需經滅菌0.22μm孔徑濾膜濾過處理。

三、血清

培養中常使用小牛血清(或胎牛血清)。血清亦不能高壓滅菌,無菌的小牛血清需在56℃水浴30分鐘滅活補體,置4℃冰櫃存放待用。配製時含

量視培養細胞種類、時間而定,一般用10—15%。由於血清成分複雜、條件不易控制,可選用無血清培養基。

四、抗菌素

為防止培養時期細菌的污染,可在培養基中添加適當抗菌素,一般用量與組織細胞培養相同:卡那黴素100單位/毫升,或雙抗--青黴素100單位/

毫升,鏈黴素100微克/毫升。

五、植物血凝素(PHA)

非增殖期的細胞不能製備染色體,如人外周血淋巴細胞,但在離體培養過程中,在PHA的作用下,可被刺激轉化為淋巴母細胞而進入有絲分裂。

經實驗測定其分裂高峰分別於培養後44—48小時和68—72小時。

PHA有粘多糖,蛋白質兩種重要成分。粘多糖促使有絲分裂,蛋白質起凝集作用。PHA激活的細胞數隨其濃度而增加,直至全部免疫活性細胞均

被激活為止,但PHA濃度過高會引起凝集,一般採用4%濃度為好。

注意事項

培養基在使用前通過高壓或過濾滅菌。防止污染應該注意以下事項:

確認工作細胞庫是否被污染:用細菌、真菌及支原體無菌試驗來確認並排除。同時要對無菌試驗培養基的靈敏度進行驗證。

確認毒種工作種子批是否被污染:用細菌、真菌及支原體無菌試驗來確認並排除。同時要對無菌試驗培養基的靈敏度進行驗證。

確認所用培養基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染:用細菌、真菌及支原體無菌試驗來確認並排除。同時要對無菌試驗培養基的靈敏度進行驗證。實際生產中,可以從配製好的培養液中取少量加入營養瓊脂於恆溫培養箱內培養,48小時即可觀察有無污染。

其它:高壓滅菌設備、過濾除菌設備均應進行驗證,確保滅菌和除菌效果;前者應在投產前及其後的每6個月進行驗證,後者應在每次除菌前、後進行驗證工作(至少應在除菌後進行一次)。

另外,應將有毒區與無毒區嚴格分開,並有各自獨立的空氣淨化系統及孵室,有毒區對無毒區應保持相對負壓,防止病毒對培養細胞(尤其是細胞庫)的污染。

相關詞條

相關搜尋

熱門詞條